基因“剪刀” CRISPR/Cas技术

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分类：新闻中心
作者：盖德视界
来源：公众号
发布时间：2023-02-27
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病毒自发现起，就一直与人类斗争。其实，病毒不仅寄生生物体，也入侵细菌：病毒能把基因整合至细菌，并利用其细胞工具为自身的基因复制服务。相对地，细菌演化出的CRISPR/Cas系统能发现并切除病毒基因，也是其特有的免疫系统。

CRISPR/Cas系统的基本工作原理是，CRISPR序列经转录形成crRNA的前体；随后，该前体经加工形成具有靶向识别功能的crRNA；Cas作为一种核酸内切酶，与成熟的crRNA形成RNA-蛋白质结合体；而后，crRNA与特定的DNA序列特异性结合，Cas切断靶向的DNA链，使基因产生缺口，实现“打靶”；最后，通过同源重组或非同源末端链接等方式进行基因修复，实现基因编辑。

CRISPR/Cas系统结构

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CRISPR/Cas系统由识别组件CRISPR和切割组件Cas（CRISPR- associated proteins）组成。CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区和间隔区组成。其中，间隔区即是被细菌俘获的外源DNA序列，属于“黑名单”片段；前导区是CRISPR序列的启动子。而前端的Cas基因是一段具有多态性的家族基因。在此结构的基础上，CRISPR序列与Cas基因共同进化，形成了高度保守的CRISPR/Cas系统。因此，第三代基因编辑工具CRISPR/Cas技术诞生。

图1 CRISPR基因位点结构

图片来源：标图网

2013年，美国麻省理工学院张锋和哈佛大学George Church研究组首次在细胞中利用CRISPR/Cas9系统，实现了基因定点突变技术。如今的研究已发展至与CRISPR-Cas9功能类似，但结构更简单的CRISPR-Cpf1（Cas12a）及用于RNA活细胞标记的CRISPR-Cas13a。

图2 CRISPR/Cas9、Cas12a、Cas13a的对比总结

图片来源：[2]

合成生物学领域

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Cas9蛋白作为CRISPR系统中最常用的切割原件，在基因的编辑、改造方向应用广泛。而合成生物学以人工设计与编写基因组为核心，旨在利用加工后的细胞元器件，满足特定需求。因此，设计和构建元件库的重要性不言而喻，而这也恰好与CRISPR/Cas系统的基因编辑功能不谋而合。

大肠杆菌是微生物合成生物学研究中重要的模式生物。2013年，Jiang等首先在大肠杆菌中使用CRISPR/Cas9系统，即利用Cas9切断目的基因，再引入λ-Red蛋白修复，将突变序列引入宿主，证实了该系统在大肠杆菌中可进行有效的基因编辑，且突变率达到65%。如今，CRISPR/Cas9技术在大肠杆菌合成生物学中的应用广泛且较为成熟。

CRISPR/Cas12a系统在研究中常用于蓝细菌的基因编辑。2019年，Niu等利用不同抗性标记多个基因组，同时使用蔗糖敏感性质粒，使其在完成编辑后主动丢失，实现了染色体大片段DNA缺失，单基因修饰达成功率100%。

在DNA的谱系追踪领域，CRISPR/Cas9可对转基因DNA靶标进行体内编辑。分子记忆装置，基于Cas内切酶、DNA靶点序列和一组sgRNA，累计靶点可变性，在细胞内产生多样化的“进化版”DNA条形码，并促进细胞谱系树的系统发育重建。